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RTPCR,反转录·聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)是将RNA的反转录(reverse transcription )和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。
RTPCR,反转录·聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)是将RNA的反转录(reverse transcription )和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。
提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
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荧光定量RT-PCR技术是世界各国疾病控制中心(CDC)采用的金标准。通常使用RT-PCR技术体外扩增病毒的RNA的两个片段,其中一个是编码核衣壳(N蛋白)的基因,另外一个编码S蛋白/M蛋白/E蛋白/1ab蛋白的基因。
虽然RT-PCR是世界各国公认检测病毒的金标准,但是,由于其准确率约为70%、耗时较长(4~6小时),且需要完备的、精密的实验室设备和操作熟练的技术员,导致该技术在落后的地区或者国家无法大规模的采用。所以,研发耗时更短、操作更简单、价格低廉的检测手段是十分迫切的。
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