Klenow 酶是 1974 年 Klenow 用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA 聚合酶 I， 得到两个片段， 其中大片段的分子量为 75kDa， 它具有 5' -3' 聚合酶和 3' -5' 外切核酸酶的活性， 小片段具有 5' -3' 外切核酸酶活性。 由于大片段失去了 DNA 聚合酶 I 中会降解 5' 引物的 5' -3' 外切核酸酶的活性， 所以在基因工程中更有用。

Klenow 酶主要有下列用途：

(1) 修复反应， 制备平末端 可用 Klenow 酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的 5' 或 3' 突出末端， 制备平末端， 这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA 片段通过平末端重组。 如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸， 用这种末端填补的方法可以制备 3' 末端标记的探针。 用 Klenow 酶修复 5' 突出末端的反应主要是利用了 Klenow 酶的 DNA 聚合酶活性， 是填补反应； 而修复 3' 突出末端则是用 Klenow 酶的3' -5' 外切核酸酶的活性， 是切割反应。 用 Klenow 酶的切割反应来修复 3' 突出末端是不理想的， 改用 T4DNA 聚合酶或其他的酶是更好的选择。

(2) 标记 DNA3' 突出末端(protruding end) 该反应分两步进行： 先用 3' -5' 的外切核酸酶活性除去 3' 突出末端， 产生 3' 隐含末端， 然后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP) 存在下， 使降解(3' -5' ) 作用与聚合(5' -3' ) 作用达到平衡。 这种反应也叫交换或取代反应(exchange／ replacement reaction) 。 不过这一反应用 T4DNA 聚合酶的效果更好， 因它的 3' -5' 外切核酸酶活性较强。

(3) 其他的一些用途： 包括用双脱氧末端终止法进行 DNA 序列分析、 用于 cDNA 第二链的合成、 在定点突变中用于合成第二链、 用引物延伸法(primer extension) 制备单链 DNA 探针等。